安諾Hi-C輔助組裝合作文章再登Nature Communications
2019.04.04

An apple a day keeps the doctor away,很多人都喜歡吃蘋果,吃的時候你想過為什么蘋果會有不同的顏色嗎?小編都沒想過原來果皮顏色不同還是一個重大的科學問題。就在前日,中國農業科學院果樹研究所叢佩華研究員課題組在Nature Communications在線發表了題為A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour 的文章,揭示了轉座子和紅色果實顏色的相關性。在本研究中,安諾優達承擔了Hi-C輔助組裝分析工作。

 

該研究通過聯合使用PacBio單分子實時(SMRT)技術,染色體構象捕獲技術(Hi-C)和光學圖譜技術,組裝了蘋果花藥來源的純合系HFTH1的染色體級別的高質量基因組(基因組大小為658.90 Mb, contig N50為6.99 Mb,17條染色體)。與金冠參考基因組比對,在HFTH1基因組中鑒定了18,047個缺失,12,101個插入和14個大的倒位。研究揭示這些變異主要是由轉座子引起,其中研究發現長末端重復(LTR)逆轉錄轉座子插入MdMYB1的上游,它是花青素生物合成的核心轉錄激活因子,與紅色果皮表型相關。


基因組組裝和評估


為降低組裝復雜度,使用花藥來源的三倍體寒富系蘋果(HFTH1)進行基因組測序,其供體寒富是高度雜合的二倍體栽培種。微衛星標記、k-mer分析、流式實驗證實HFTH1基因組為純合三倍體,表明HFTH1在體外培養期間經歷了自發的染色體重復。與最近發表的雙單倍體金冠系基因組相比(GDDH13),HFTH1更純合,更有利于改善基因組組裝質量。


本研究對HFTH1基因組進行了PacBio三代測序,二代測序,光學圖譜和Hi-C測序。利用PacBio三代數據組裝基因組,二代數據糾錯,隨后使用光學圖譜數據將基因組提升到scaffold水平。最后,利用Hi-C數據進行準確聚類、排序和定向,組裝出658.90 Mb基因組,17條染色體,22條長的端粒序列,contig N50為6.99 Mb,接近k-mer分析預估的HFTH1基因組大小(708.54 Mb)。BUSCO評估完整性為97.0%,EST評估編碼區完整性為98.02%,確認該基因組組裝的高完整性和準確性。

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基因組注釋


文章共鑒定了44,677個高可信度蛋白質編碼基因,注釋基因覆蓋了95.9%的完整BUSCO基因,約92.28%的注釋基因在至少一個組織中表達或與已知蛋白同源,表明基因注釋非常完整。文章結合從頭和基于同源法來注釋重復序列。在HFTH1和GDDH13基因組中分別鑒定了約393.88 Mb和362.18 Mb轉座子(TE)。


寒富與金冠比較基因組分析


寒富與金冠具有明顯不同的表型,包括紅皮,強抗寒性,抗葉斑病,抗枝條腐爛,果實耐貯性等。通過SNP和GDSV分布的全基因組圖譜,GDSV和SNP相關基因的富集分析結果一致,均與抗病結構域顯著相關。超過70%的GDSV與TE相關,且寒富與金冠的TE分歧率存在顯著差異。此外,文章共鑒定了18,047個缺失和12,101個插入,包括14個長度超過100 Kb的大片段插入變異(INV),其中兩個超過600 Kb,并且這兩個INV的所有斷點都位于TE元件內,提示可能是TE導致了插入變異的產生。



逆轉錄轉座子作為MdMYB1表達的

增強子


文章通過組裝的基因組來研究重要農業性狀,專注于研究蘋果果實的紅色表型。遺傳證據表明,MdMYB1是花青素生物合成途徑的核心轉錄調控基因,調控紅色表型。通過qRT-PCR檢測到寒富和金冠成熟果皮中MdMYB1和花青素相關結構基因的轉錄水平之間存在顯著差異。非紅果實品種中的MdMYB1等位基因在強光和低溫下表現出有限的表達。


文章在HFTH1和GDDH13基因組中進行了MdMYB1序列比對,結果顯示MdMYB1的編碼序列相同,但在HFTH1中,有一段4097 bp的插入,位于MdMYB1的ATG起始密碼子上游3297 bp處,并且是具有兩個TSD的gypsy式LTR反轉錄轉座子(表示為redTE,CATAT)。為了研究redTE與紅色果皮顏色的關聯,本文通過redTE特異PCR標記篩選確定了112個具有已知表型的紅果實種質和33個非紅果實種質,結果顯示,所有測試的紅果實種質均含有redTE但在非紅果實種質中未發現redTE。此外在紅果實蘋果Honeycrisp和非紅果實蘋果Huayue的后代F1中也表現出了redTE與紅色果實性狀的共分離,這些實驗表明redTE插入可能是蘋果紅色表型的原因。進一步在煙草中進行瞬時轉染實驗檢測redTE對熒光素酶基因表達的影響,結果表明redTE能夠增強酶基因表達活性,提示redTE作為功能轉座子發揮MdMYB1光響應基因表達的局部增強子功能。


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圖2 蘋果的紅色表型與LTR反轉錄轉座子相關[1]


該研究不僅揭示了蘋果紅色果實著色的遺傳基礎,且發布的染色體級別高質量基因組為蘋果重要農業性狀的研究和遺傳育種提供了依據。


安諾基因作為國內優質的二、三代測序服務商,配備了PacBio Sequel、Hiseq X Ten、Novaseq 6000等全面的測序平臺和一流的技術團隊。安諾基因的特色產品Hi-C輔助組裝技術目前已經累計發表商業合作文章4篇,影響因子近50在基因組組裝方向,已積累100+項目經驗,涉及林木、中草藥、農作物、哺乳動物、昆蟲、海洋生物等各個方向,部分相關研究成果已發表于Molecular PlantNature Communications等國際高水平期刊,累計IF 130+。歡迎感興趣的老師前來咨詢~

 

參考文獻:

[1] Liyi Zhang, Jiang Hu, Xiaolei Han, et al. A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour[J]. Nature Communications. 2019.04.02.




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